互动科普

间隙连接通道是介导信息联系的结构基础，是细胞语言学的基础。组成间隙连接通道的连接子由连接蛋白亚单位聚合而成。原癌基因、酪氨酸激酶、生长因子等均可通过磷酸化来改变连接蛋白结构，调节细胞间隙连接通讯。

间隙连接(gap junction GJ)通道存在于相邻的两个细胞之间，并将它们连接起来。除了一些终末分化的细胞，如骨胳肌细胞，红细胞、以及循环的淋巴细胞外，几乎所有组织中都存在GJ通道。细胞可通过此通道直接传递离子、小分子代谢物质与次级信使，使其活动协调一致，如心肌和平滑肌的收缩，神经元信号在电触突的传递，胰腺内、外分泌功能的调控等。此外，GJ介导的细胞通讯在胚胎发育、细胞分化和生长调控等生物过程中起重要作用。本文综述GJ通道的生物合成、特性、功能调节的研究进展．

一、连接蛋白家族与连接子

GJ通道是由一个细胞膜上的连接子(connexon)与相邻细胞的连接子相衔接形成的膜通道，连接子由六个哑铃形的连接蛋白(connexinCx)亚单位组成。自从1986年克隆出第一个Cx43以来，迄今为止，已发现13种Cx．Cx是GJ的主要蛋白成分，决定着GJ通道的性质．大量的事实证明，Cx可独自形成GJ通道，这些事实包括：(1)将提纯的Cx重组入人工膜形成功能性的GJ通道；(2)Cx的序列与完整膜蛋白的序列一致，具有形成功能性通道所需的含极性氨基酸的跨膜结构域：(3)在异质系统(heterogeous system)如酵母菌表达的Cx不仅可以形成功能性的GJ通道，而且其超微结构与活体上的相同；(4)免疫细胞化学电镜观察到GJ斑上有Cx沉积：(5)Cx在活体组织中的分布与连接通讯的途径有关．

所有的Cx都有4个跨膜疏水区ml-m4，两个细胞外环E1与E2，一个胞浆环CL，其氨基端和羧基端以及CL面向胞浆。Ml-m4区是一螺旋二级结构，绝大部分位于连接膜或间隙中．m3具有双歧性，有助通道的形成，其螺旋的转动与通门控(gating)有关。E1和E2区跨过细胞b35A的间隙，参与相邻细胞连接子的相互作用。每个细胞外环含三个保守的半胱氨酸(cysteinescys)残基，有助于维持一种牢固的三级结构，使两个相邻的连接子相互对接(docking)。E1的三个cys分别被6个和3个氨基酸隔开，而E2上的cys残基则被4个和5个氨基酸分开。Cx32除外，其E2的第一个与第二个cys残基则被5个氨基酸分开。E1与E2环间的sys至少由一个二硫键连接起来。Cx家族成员之间的同源性高达50-80，主要在细胞外的两个结构域，其次是跨膜结构域，细胞质内的结构域差别最大，这种差别可能代表Cx成员的组织差异性和与通道有关的多种细胞内调节机制以及电传导通讯的差异。

Cx基因具有一个共同的结构：每个基因中都含有一个内含子，位于5，一非翻译区(5-UTR)，将上游的一个小的未编码的外显子与含整个编码顺序的大的外显子分开。Cx43的转录起始点位于外显子1上游18Ont处，在转录起始点上游的DNA序列含有一个AP1结合点和退化的TATA盒子。3-UTR高度保守，包括4个AUUUA标纹(motif)，此序列与基因早期的不稳定转录有关。Cx基因在人类染色体上的定位并不像球蛋白那样集中在一个特定的染色体上，而是分散到不同的染色体。人的Cx26、Cx32、Cx43、Cx46DNA分别位于13．X、6、13号染色体上。所有的Cx组成一个多基因家族，Cx基因结构的差别决定着不同连接子的功能。

大多数细胞不止表达一种类型的C，因此活体上可能存在异聚体连接子(heteromeric connexons)。理论上，间隙连接通道可分为两种：一种是同型GJ(11omotypicGJ)，由两个含相同的Cx的连接子组成：另一种是异型CJ(11eterotypicGJ)，包含两个不同的连接子，组成连接子的Cx亦不同。最近，Jiang等“用免疫沉淀法”证实了在体上有异型连接子。由于不同的Cx通透性各不相同，故推测异聚体连接子具有独特的生理性质。此外，一些连接子间潜在的不相容性还可以产生其它影响，如相互接触的细胞群问形成通讯屏障。对异型连接通道的研究有助于了解GJ通道形成和功能调节机制。

二、GJ通道的形成

GJ通道由两个功能完整的连接子(半通道)构成，其形成是一个复杂的过程，主要包括：(1)Cx的合成Cx在粗面内质网上的合成是GJ通道形成的第一步。(2)Cx聚合形成连接子(半通道)，并转运和插入细胞膜目前普遍认为Cx的聚合是在内质网上进行的，肝脏亚细胞成分分析的结果证实内质网上有Cx聚合体，但有人发现Cx43的聚合发生在转运高尔基复合体(trans Golgi Complex)上。在聚合之前，参与蛋白一蛋白相互作用以及通道形成的Cx区域将直接与脂质双分子层的疏水区相互接触．关于Cx聚合体从高尔基体转运到细胞膜的细节还有待进一步探讨，早期的研究认为Cx的磷酸化可将Cx运输到细胞膜，但后来发现磷酸化并非转运Cx所必需，它仅参与GJ通道的合成以及通道的门控(gating)。(3)连接子(半通道)对接组成细胞首先，相邻细胞的两个连接子必须相互识别和准确排列，并通过非共价键结合，此结合能将通道固定于细胞外区域；其次，是两个相互对接的半通道的开放。影响细胞间通道形成的因素有以下两种：(a)外在因素包括粘附分子、植物凝血素(lectin)、脂质、Ca2+、H+。钙粘素(cadherin)以一种钙依赖方式将相邻细胞膜连接起来，有助GJ通道形成。在高度转移的病变中，GJ与钙粘素的减少相一致。细胞外低钙有助细胞的偶联，高钙可提高细胞间染料的传输。胆固醇与低密度脂蛋白(LDL)在通道的形成和调节中的作用随其浓度而变。细胞外高pH值有助连接通讯的形成。(b)内在因素虽然Cx间有高度同源性，但并非所有的连接子均可配对。由二硫键相连的两个细胞外环在半通道的识别和对接中具有重要作用，其中第二细胞外环对Cx的相容性来说至关重要，外环上任一个cys残基突变或第一、第三个cy8残基位置的改变可完全阻断细胞间的Cx32GJ通讯，故推测这一cys残基在GJ通道的对接和开放中起重要作用．后来发现Cx的C-末端区对GJ通道的形成亦有一定意义。(4)连接子聚合形成间隙连接斑。

三、GJ通道的通透性和电压依从性

无机离子和许多小分子物质均可由GJ通道传递，但特异性酶、蛋白质、核苷酸则不能通过。传统的观点认为GJ对分子量小于1000道尔顿的小分子物质的通透性是非选择性的，但近来的研究发现，分子的大小并不是GJ通道通透性的唯一决定因素，Cx本身的结构或其翻译后不同的修饰才是GJ通道通透性的决定因素。不同的Cx具有不同选择性和通透性，而且与通道的传导性无关[13]，此差异使有关细胞群受到特异性次级信使或代谢物浓度变化的调节。

GJ通道通透性的差异对正常的生理过程来说十分重要．如角化细胞的分化中存在Cx43Cx26向Cx31和Cx31. 1的转化，同时通道通透性发生改变，对萤光染料的传输减少，故推测在此细胞的不同分化阶段，细胞间传递的有关生物分子是不同的。

对重组的GJ通道及其生物物理特性的研究表明各种Cx都有一个单通道(single channel)，其传导范围为30-300ps，它反映了Cx序列的差别。有的Cx的酪氨酸磷酸化与其它的翻译后修饰可致Cx结构改变，影响到GJ通道的传导性和通透性。因此，像其它通道一样，GJ通道亦可以通过门控来调节，使细胞对各种生理事件迅速作出应答，但还不清楚通道通透选择性的分子学基础。

GJ通道是电压依从性的，其依从性的程度随Cx类型变化。通过的传导性是由两个偶联的细胞间的电势差即传导连接电压(trans junctional potential Vj)来调节，亦可由细胞内外的电势差来谓控。电压依从性在非兴奋组织中的作用不甚明确，可能是将受损细胞与周围正常细胞分开．因为GJ通道有同型和异型之分．所以它们的电压依从性各不相同，由Cx32或Cx26组成的同型GJ通道的电压依从性很相似，当vj小于50mv时，其电压敏感性极不稳定，且无瞬时电压依从性；Cx32／Cx26异型GJ通道则表现出不对称的瞬时电压依从性，当Cx32占优势时，电压依从性的稳定性消失。Cx的电压依从性通常Boltzmann参数来定量．异型GJ通道的电压依从性由组成通道的Cx类型决定．分子生物学的研究证实许多电压依从性通道都有一个决定电压敏感性的结构域，称为s4区，它是一个独特的氨基酸残基的延伸，跨越质膜，且每隔三个位点就有一个正电荷残基。CxGJ通道无S4区，Cx的第一个细胞外环(E1)和第二个跨膜区(m2)是其电压依从性决定因素。E1感受电压变化，而m2中的脯氨酸残基则是电压感受器和电压门控的转换因子。

四、GJ通道功能的调节

GJ功能的调节对细胞通讯来说意义重大，胞浆PH、Ca2+、电压、原癌基因、核苷酸、激素、神经递质、脂质、生长因子和许多外源性化学物质均可在转录、翻译、翻译后修饰水平调节GJ功能，这些调节是由多种机制实现的。近来．就Cx磷酸化如何影响GJ功能进行了大量的研究。

除Cx26外，其它Cx都是磷酸蛋白．氨基酸序列分析证明正常情况下，Cx磷酸化主要发生在丝氨酸(serine Ser)残基，亦可发生在苏氨酸(thernonine Thr)残基．Cx43磷酸化位点主要在羧基端271-282氨基酸残基之间。用鸡钙粘素基因转染的S180细胞呈现出Cx43基础磷酸化形式，且能通过GJ进行细胞间的通讯，说明基础磷酸化可调节Cx43的运输.Musile和Goodenough证实在NRK细胞中，Cx43-P2(Cx43)的一种磷酸化形式不能被去垢剂Triton-x-100溶解，而大多数非磷酸化Cx43(Cx43-NP)则是去垢剂可溶解的。生物素标记(Biotinylation)试验进一步证实Cx43-P2的转化发生在GJ形成过程中或形成以后，调节连接子整合进连接斑。Ser／thr磷酸化可影响到通道的活性。Moreno等测定了转染有Cx43的SKHep-1细胞单通道传导性(unitary conductance rj)。发现细胞呈现出两组主要的rj，分别是65ps和100ps。pkA和pkC抑制剂以及磷酸酶可增加大rj事件发生的频率，提示磷酸化的改变影响到单通道传导状态的分布频率．

生长因子与病毒原癌基因影响到细胞间隙连接通讯(gap junction inter celluar communication GJIC)，其作用与Cx磷酸化基础状态的改变有关，最典型的例子是用pp60v-src酪氨酸激酶抑制GJIC，在有Cx43和pp60v-src共同表达的细胞，Cx43酪氨酸残基磷酸化，抑制GJIC。pp60v-8rc可能主要在通道门控水平发挥作用。ras原癌基因对GJIC的作用与Cx丝氨酸磷酸化有关．此外，其它两个原癌基因的病毒酪氨酸激酶v-fp8和v-yes同样亦可磷酸化Cx43．抑制GJIC，但还不清楚f激酶是直接磷酸化Cx43，还是激活下游的酪氨酸激酶．酪氨酸磷酸化并不影响所有的Cx，src激酶对Cx32GJIC无影响．

受体酪氨酸激酶亦可抑制GJIC，但它不直接由Cx酪氨酸磷酸化介导，EGF只能在丝氨酸残基磷酸化Cx43，它由丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联反应介导的，MAPK在Ser255、279、282位点上磷酸化Cx43．同样，PDGF所致的通讯抑制亦不依靠Cx43酪氨酸磷酸化，PDGF激活一些参与信号传导的蛋白，通过多种机制抑制GJIC．肝细胞生长因子／分散因子是酪氨酸激酶的配体，但也可不经过Cx43磷酸化来抑制小鼠角化细胞的GJIC．

TPA(12-0-tetradeconylphorbol-13-acetate)是种促癌物质，可迅速抑制85-90%的GJIC，长期作用可完全抑制GJ并使GJ斑消失。TPA的作用与过度磷酸化有关，它可通过激活一个或多个pkC异构体来起作用，推测过度磷酸化是由蛋白激酶C(pkC)引起的，因为此酶可被TPA激活，并直接磷酸化Cx43还不清楚。IPA磷酸化的氨基酸残基，有的可能位于Cx43羧基末端，与pkC的识别位点一致。Matesicb等发现Cx43过度磷酸化与GJIC介导的染料传输的抑制同时发生(TPA处理后5分钟)，但免疫染色的消失却很缓慢(15分钟后检测不到)，表明TPA在多个水平发挥作用，开始影响通道的通透性，随后又影响到Cx的转运和／或合成。

TPA对通道门控和／或通透性的作用很复杂，TPA对细胞间染料传送的抑制与单通道事件分布向最小的rj转换相一致。Cx的多样性使TPA对细胞间通讯的作用更复杂。小鼠角化细胞和WB-F344细胞上有Cx43和Cx26表达，由于Cx26无磷酸化形式，故推测TPA对GJIC的抑制与Cx26表达水平较Cx43低有关；或Cx26通道虽然很多，却无活性。研究发现此时GJIC的抑制不完全(85%-90%)。在有的细胞中，TPA对间隙连接通讯的形成作用不大。Lampes等发现TPA抑制染料在Norikoff盱癌细胞间的传递，这些细胞是有EDTA分离重新聚合的，但对未用EDTA分离的肝癌细胞，TPA则无作用。此外，GJIC的抑制与Cx43过度磷酸化有关，但并不影响它的水平，推测TPA抑制了质膜相关的Cx43组成有功能的GJ。TPA可将pkC从胞浆转移到胞膜，Cx43整合入连接子后定位于细胞膜。TPA可影响GJ通道形成的最后一步，连接子组合形成细胞间通道，连接通道聚集形成GJ斑。

cAMP亦可改变Cx磷酸化状态，在一些细胞中，cAMP可增加GJs，如肝细胞；在另一些细胞中，则使GJ减少，如子宫平滑肌细胞。此差别可能与不同Cx的分子结构以及组织细胞的生理状态有关，在一些肿瘤细胞系，GJ通道通透性的增加与Cx43的转录有关，但cAMP亦可在通道组成水平上调节GJIC。Atkinson证实cAMP可增加小鼠乳腺癌细胞的Cx43增加，提高GJIC，但未发现Cx43mRNA和蛋白水平的增高，提示cAMP可调节细胞Cx43分布，使细胞内池中的Cx整合到细胞表面的连接通道，产生缓慢而持久的作用。与之相反，cGMP磷酸化Cx则可使通道通透性下降，rj向小事件转化．

激酶对Cx磷酸化的调节机制目前还不十分清楚。TPA和某些生长因子的抑制效应可能由pkC介导，而其它因素，包括ras、EG蛋和其它有丝分裂的磷脂溶血磷酸则通过上调MAPK来磷酸化Cx的丝氨酸残基，从而抑制GJIC。

五、展望

近年来，随着Cx基因的克隆、GJ通道晶体结构学的研究，阐明了诸如GJ通道孔位置、连接子作用以及与通道门控有关的结构变化等问题，使细胞间通讯的研究取得了巨大进展．实验表明构成GJ通道的Cx具有各自的单通道传导性、通透性、调节特性，Cx在组织稳态的维持中具有举足轻重的作用．由于许多疾病的发生与GJ通道功能的失调有关，而对GJ通道门控机制的研究可能针对C道设计出相应的药物来改善GJIC，因此，寻找改善GJIC的药物可能是某些疾病防治的一个新研究方向。