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人工碱基：超越自然界

科学家成功地向细菌DNA引入了两种自然界不曾存在的人工碱基，制造出了半人工的细菌，在其他生物体上取得类似的成功或许也不会太远。

本刊记者 陈彬

另一方面，这种简单性也使得DNA的信息编码能力相对受限。随着人类对生命的理解越来越深入，改造生命的“野心”越来越大，研究人员近年来一直在尝试增强DNA的信息编码能力。通过向DNA中添加入两个新的“字母”，科学家在这一领域取得了重大的突破——他们已经构建出了半人工的生命。

寻找“新密码”

很多人都喜欢玩乐高积木，这种玩具之所以风靡全球，是因为使用有限种类的积木模块，你可以拼接搭建出几乎无数种建筑和场景。和乐高积木类似，所有生物的DNA也是由有限种类的模块“拼接”出来的，只不过这些模块只有4种。通过把这些模块按不同的顺序拼接到一起，一个生物体的所有遗传信息得以写入DNA。毫不夸张地说，DNA是一本记录着生物体有关生长、发育、繁殖等所有信息和指令的“生命之书”（这些生命活动会受环境等因素的影响，但生物体对这些因素作出怎样的反应，一定程度上仍可以看作是由DNA编码的），而写就它的就是上述4种不同的“字母”。

构成DNA的这4种字母，是一类叫脱氧核糖核苷酸的有机小分子。每一种脱氧核糖核苷酸都由脱氧核糖（一种含五个碳原子的糖）、磷酸基团和碱基三部分组成。磷酸基团就像乐高模块上的突起和小孔，可以让各个脱氧核糖核苷酸分子以“手牵手”的方式连接成一条长链。编码有效遗传信息的是脱氧核糖核苷酸上的4种碱基：A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）。为了简便起见，科学家常常把DNA上含这4种碱基的脱氧核糖核苷酸也简写成A、T、C、G（下文也会这样简写）。

为了保证遗传信息忠实传递给子代，细胞的DNA由两条“互补”的单链构成。两条链上的碱基会发生相互作用，两两配对，形成氢键，从而把两条单链“捆绑”到一起。碱基间的配对遵从一种“互补”原则：A和T配对（也就是“互补”），C则和G配对。在复制DNA的时候，细胞会解开DNA的双链，然后分别以这两条链为模版，按照互补原则，合成新的DNA链，最后形成两条双链DNA。这种“半保留”的复制方式使细胞中的遗传信息得以忠实地代代相传。

尽管一个生物体中含有各种不同的细胞，但每个细胞中的DNA序列却都是完全相同的。各种细胞之所以形态和功能各不相同，是因为它们从这本“生命之书”中读取和使用信息时的“侧重点”各不相同：有的读取的是“消化系统”这一章，有的读取的是“神经系统”这一章……

通过不同的排列组合形式，A、T、C、G可以形成各种序列，为生物体的DNA提供强大的信息编码能力。然而随着科技的进步，人类利用、改造生命的能力和“野心”也变得越来越强、越来越大。由4种“字母”提供的信息编码能力将可能无法满足人类的需要。一个最明显的例子出现在非标准氨基酸（nonstandard amino acids）的应用领域。DNA上的基因是细胞用来编码并合成蛋白质的“蓝图”。这幅“蓝图”以三联体密码的形式，指导细胞合成各式各样的蛋白质。

A、T、C、G的排列组合一共可以产生64种（43）不同的密码，其中61种被细胞用来编码自然界中的20种标准氨基酸（一个密码对应一种氨基酸，但一种氨基酸可以由数个密码编码）。标准氨基酸是大自然中各种生物使用的“主流氨基酸”，绝大多数生物合成的绝大多数蛋白质都只含有这些标准氨基酸。剩下的3种密码，分别是TAA、TAG、TGA（在RNA中这些序列叫做“密码子”，分别是UAA、UAG和UGA，其中的U，也就是尿嘧啶，专门存在于RNA中，对应于DNA中的T），是蛋白质合成的终止信号（所以相应的这3种密码子被称为“终止密码子”）。在所有生物的细胞中——无论是在细菌、大猩猩还是人类中，这些密码所编码的信息都是一样的，比如ATG都编码一种名为甲硫氨酸的氨基酸，而TAG则都是蛋白质合成的终止信号。

通过对基因序列进行改造（比如各种形式的突变），科学家能让细胞合成出具有新特性的蛋白质，并加以利用（比如用作药物） 。有的科学家试图通过加入非标准氨基酸（前述20种标准氨基酸之外的其他氨基酸）来赋予蛋白质新的结构和功能。要把这种方法在细胞中付诸实施，至少要用一种密码来编码这些非标准氨基酸才行。遗憾的是，由A、T、C、G组合成的64种密码都已经承担了各自的编码任务。

要解决缺乏密码的困境，最直接的方法就是向细胞的DNA加入A、T、C、G之外的其他碱基。哪怕只是多出一对非天然碱基（Unnatural Base Pairs，简写为UBP），细胞的密码就会增加到216种（63），可以为编码非标准氨基酸提供大量的密码。

“最佳搭档”

通过生物学手段向DNA中掺入UBP的尝试最早始于1989年。使用含有一个非天然碱基iso-C的DNA单链为模板（模板是通过化学方法合成的），并以另一个非天然碱基iso-G和其他4种天然碱基为“原料”（iso-C和iso-G分别是天然碱基C和G的类似物，可以像后两者一样配对），瑞士科学家史蒂文·A·班纳（Steven A. Benner）和同事成功合成出了与模板互补的另一条DNA单链。

在此后的研究中，科学家又发现了更多可以掺入到DNA中的UBP，但略显遗憾的是，过去15年间的所有进展，都是在离体条件下取得的，也就是说实验并不是在细胞内，而是在模拟细胞内环境的溶液中进行的。

2014年5月，这一领域终于取得了重大的进展。美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）的弗洛伊德·E·罗姆斯伯格（Floyd E. Romesberg）领导的研究组在《自然》（Nature）杂志上发表了他们的研究成果，首次把含有UBP的DNA引入到了细菌（大肠杆菌）中。在提供DNA合成“原料”的条件下，这些DNA能被细胞准确复制，并分配到分裂产生的子代细胞中去。由于这些细菌的DNA含有自然界此前从不存在的物质，所以通过这项研究，科学家相当于构建出了半人工的生命（a semi-synthetic organism）。

此前的研究发现，UBP间的配对方式主要分为两种。一种是通过碱基间形成氢键来实现配对，班纳及其同事使用的iso-C和iso-G间的相互作用就属于这一类。另一种方式则完全不同，是通过碱基间的疏水作用来实现配对。罗姆斯伯格实验室使用的就是这类通过疏水作用配对的碱基。（当然，除了上述两种方式，还有其他相对少见的配对方式，比如与金属离子的配合来形成碱基对，以及完全基于结构／形状互补而形成的碱基对。）

与通过氢键配对的UBP相比，通过疏水作用配对的UBP有很大的优势。罗姆斯伯格实验室的陈庭坚博士是这项研究的参与者之一，他告诉《环球科学》记者：“疏水性能为非天然碱基的配对提供很强的相互作用力，同时还能降低非天然碱基和天然碱基间发生错配的可能性，”从而提高DNA复制的保真度，降低因错配而导致非天然碱基丢失（这种丢失发生在下一轮的DNA复制过程中）的可能性。

要找到符合要求的UBP非常不容易。两种非天然碱基不仅要能够配对，足够稳定，还要能被细胞中负责DNA复制和转录（为了指导蛋白质的合成，细胞从DNA上读取遗传信息，合成出RNA的过程）的各种分子高效地识别和利用。“这就需要把非天然碱基的各种性质优化到和天然碱基相当的水平，”陈庭坚说，“过去15年甚至更长的时间里，我们实验室一直在做这方面的工作”。

2008年，罗姆斯伯格实验室研究了60种非天然碱基的3 600种（602）可能存在的配对，最终发现了一对符合要求的UBP——d5SICS和dMMO2（下文把这种碱基对简写为d5SICS：dMMO2）。如果一条DNA链中含有这两种非天然碱基中的任意一种，那么以这条DNA链为模板，都能成功地在模版的互补链中掺入另一种非天然碱基，使DNA复制得以继续进行。遗憾的是，与天然碱基的掺入效率比起来，这对碱基的掺入效率非常低。好在一年之后，罗姆斯伯格实验室的研究人员就找到了更好的组合。通过把dMMO2的两种衍生物与d5SICS分别配对进行实验，陈庭坚的同事发现非天然碱基对d5SICS：dNaM的掺入效率要高得多，与天然碱基的掺入效率相近。因此，d5SICS：dNaM当仁不让地成为在细胞内进行掺入实验的“搭档”。

半人工生命

要想把UBP掺入细胞的DNA，要解决的第一个问题是如何给细胞提供DNA复制所需的“原料”（合成DNA的“原料”都以dNTP的形式存在，它们比组成DNA的脱氧核糖核苷酸多出两个磷酸基团，“N”代表各种碱基）。对于d5SICS和dNaM来说，“原料”就是d5SICSTP和dNaMTP。一个最简单的方法就是直接在细胞的培养液中加入含d5SICS和dNaM的脱氧核糖核苷（脱氧核糖核苷由脱氧核糖和碱基构成，不含磷酸基团），让细胞自己摄取这些脱氧核糖核苷，再由细胞中负责合成天然dNTP的各种酶，把磷酸基团一个一个添加到脱氧核糖核苷上，从而合成出d5SICSTP和dNaMTP。可惜的是，不管是细胞内原有的酶，还是通过人工引入的来自其他生物的酶，都会引起这样或者那样的问题，无法让细胞自己合成出d5SICSTP和dNaMTP。这条路被堵死了。

如果给细胞提供脱氧核糖核苷行不通，为什么不想办法直接把d5SICSTP和dNaMTP引入细胞呢？从这一思路出发，陈庭坚的同事留意到了一种此前在藻类中发现的蛋白质，这种名为PtNTT2的蛋白质是一种转运蛋白，能够把dNTP转运到细胞内（PtNTT2不仅能够转运dNTP，也能转运合成RNA的“原料”，即rNTP，从而也能为非天然碱基在细胞内的转录做好准备）。在把这个蛋白的基因引入细胞之后，细胞就会合成出PtNTT2，并把它们运输到细胞的细胞膜上。就像一条大河上的摆渡人，PtNTT2能够把细胞外各种形式的dNTP和rNTP，从细胞外转运到细胞内，d5SICSTP和dNaMTP也不例外。

选好碱基对，并找到DNA“原料”的导入方法之后，罗姆斯伯格实验室开始拿活细胞做实验：为细胞提供必要的环境，看它们能否复制出含有UBP的DNA。陈庭坚和同事首先把两种不同的环状DNA（科学家把它们称作质粒）引入大肠杆菌细胞。这两种质粒的作用各不相同，一种叫“辅助质粒”（pACS，accessory plasimd），作用是引入PtNTT2的基因，使大肠杆菌能够合成出这种转运蛋白；另一种质粒的DNA序列中含有一对UBP，这种“信息质粒”（pINF，the information plasmid）的作用是充当DNA复制的模板。

UBP在信息质粒上的位置也是经过精挑细选才确定下来的，陈庭坚参与的就是这方面的工作。通过选择合适的位点，可以保证UBP只被科学家选定的酶复制，降低新合成出的DNA片段被其他酶切割掉的可能性，从而使UBP能够相对稳定地保留在信息质粒上，以免在多轮复制之后，UBP逐渐被其他碱基替换、“稀释”掉。不过，信息质粒中的UBP并不是d5SICS：dNaM，而是d5SICS的一种类似物和dNaM（这种类似物也能和dNaM配对）。研究人员使用的是d5SICS的类似物而不是d5SICS，是因为只要在细胞中检测到含d5SICS：dNaM的质粒，那么就可以确定，这些质粒是在细胞内复制产生的，而不是人为引入的（在细胞复制质粒DNA的过程中，d5SICS的类似物会被d5SICS替代，因为研究人员只为细胞提供了d5SICS的“原料”）。

向细菌细胞引入上述两种质粒，并让这些细菌生长15小时后，研究人员从细菌中提取出了这两种质粒，并计算了两者的数量比。与15小时前相比，信息质粒与辅助质粒的数量比降低了一半。也许你会觉得这个结果让人大失所望，但实际上，这已经足以说明利用最初的信息质粒，细菌细胞复制出了大量新的信息质粒。在这些细胞中，由于辅助质粒不含UBP，所以这些质粒的复制能够像在普通细胞中一样正常进行。如果细胞没有同时复制大量的信息质粒，那么后者与前者的比例将几乎变为零。通过计算，科学家得出了量化的结果。短短的15小时中，细胞通过复制，把信息质粒的量扩大到了原来的2×107倍。这些复制出的信息质粒还忠实地保留着与模板DNA中相同的UBP：以质粒中天然碱基的数量作为参照，计算结果显示，和模板质粒一样，每一个信息质粒分子中都含有大约一对UBP。

为了检测这些复制出的信息质粒的稳定性，研究人员在不提供新培养液的情况下，让这些细菌细胞总共生长了6天。在细菌培养液中，作为“原料”的d5SICSTP和dNaMTP会由于不稳定逐渐降解。大约一天之后，培养液中可供细菌使用的d5SICSTP和dNaMTP几乎就完全降解掉了。即便如此，细胞内的信息质粒仍然会稳定的存在相当长的时间，直到由于没有d5SICSTP和dNaMTP供应，DNA中的UBP才在与天然碱基发生错配之后，逐渐被天然碱基所取代。这种稳定性为未来更深入的研究提供了保障：只要不断提供新的“原料”，UBP很可能会稳定地保存在DNA上。

这项研究与通常意义的转基因研究有所不同。转基因技术常常是把一个物种的DNA片段转入到另一个物种的DNA中。由于所有物种的DNA都是由A、T、C、G构成的，所以从理论上说，对DNA进行的这类改造其实都可以通过杂交、进化等途径完成（只不过会花相当长的时间）。而罗姆斯伯格实验室的这项研究，第一次把自然中不存在的成分添加到了细胞内的DNA上，更重要的是，细胞能够对这些DNA进行复制，并在细胞分裂时把它们分配给子代细胞。毋庸置疑，这些子代细胞，是一种半人工的生命。

这项研究一经发表立刻在科学界引起了极大的反响。很多大众媒体都报道了这一研究结果，毫不吝惜地使用“开创性”、“革命性”等词汇来描述这项成果。陈庭坚对此表示认同：“从大约40亿年前生命起源算起，这是生物体的遗传物质第一次含有6个‘字母’，无论从科学史还是自然史方面来看，这都是一件大事。”

这项研究不仅仅具有里程碑式的“历史意义”，同时还为很多此前很难甚至无法开展的研究和应用提供了方法。“最容易想到的一个应用就是，通过组合成新的密码子，我们能够把更多种类的非标准氨基酸编码到蛋白质中去，极大地拓宽蛋白质的功能，”陈庭坚介绍说。除此之外，在疫苗的研发、基因与蛋白质的相互作用等领域，这种方法也可能得到应用。

虽然意义重大，但是对人工生命的研究还有很长的路要走，可以说这项成果只是人类在这一领域的“一小步”。以非标准氨基酸的编码为例，细胞要合成出蛋白质，首先需要通过一个叫“转录”的过程，以DNA上的基因作为模板，合成出相应的RNA。这些RNA就像核酸合成系统和蛋白质合成系统的中间人，把DNA上的遗传信息传递给负责蛋白合成的各类分子。利用这些信息，通过一个叫做“翻译”的过程，负责合成蛋白的分子就能根据DNA上的遗传信息合成出蛋白质。

显然，要想把非标准氨基酸添加到蛋白质里，仅仅给细胞提供更多的密码子是不够的，还需要对细胞的蛋白质合成系统进行改造——这，将是人工生命研究的下一段征程。

本文作者 陈彬是《环球科学》特约记者、神经科学博士，主要关注前沿科学领域。